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抗冠状病毒抑制剂设计的又一良策

时间:2020-05-11  来源:大众医药网  作者:佚名   点击:

什么是PPI(protein−protein interaction)?答:PPI又称作蛋白质与蛋白质之间的相互作用,通常是细胞间通讯的关键调节因子,这些相互作用的失调通常会导致疾病(例如癌症)的发生。因此通过调节这些相互作用位点有利于探索疾病治疗的新方法。目前,大部分研究主要以在生理条件下自然形成的蛋白间相互作用(native protein−protein interaction)作为药物开发靶标,而对于调控非天然蛋白间相互作用靶点(non-native protein−protein interaction)的研究则鲜有报道[1, 2]。

研究亮点

近日,来自台湾国立中兴大学的候明宏团队解析了MERS-CoV N-NTD(中东呼吸综合征冠状病毒-核衣壳(N)蛋白中的N末端域)的非天然二聚体晶体构型,并以其非天然蛋白间的接触界面作为筛选的靶点,从Acros和ZINC药物数据库中筛选出具有抗冠状病毒作用的先导化合物 P3 (5-苄基氧代精氨酸)。该工作发表于Journal of Medcine Chemistry上[1]。

图1:参考文献1截图

研究思路

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)将其基因组包装在核衣壳(N)蛋白中,形成核糖核蛋白(RNP)复合体。RNP对于病毒的转录和组装至关重要。因此,通过小分子调节MERS-CoV核衣壳(N)蛋白寡聚来破坏病毒核糖核蛋白(RNP)复合体的形成是一种可行的抗病毒药物开发策略。MERS-CoV核衣壳(N)蛋白包含N末端域(NTD)和C末端域(CTD),这两个域都会参与RNA结合。MERS-CoV N-NTD结构(核衣壳(N)蛋白中的N末端域)以单体构型折叠。而MERS-CoVN-CTD(核衣壳(N)蛋白中的C末端域)则始终是天然二聚体,并通过蛋白质-蛋白质相互作用导致核衣壳(N)蛋白寡聚。总的来说,这个工作的设计思路就是利用MERS-CoV N-CTD天然的蛋白间相互作用的特点使单体的MERS-CoVN-NTD互相靠近,从而形成非天然的蛋白与蛋白间作用位点,然后以此位点作为抗病毒药物设计的靶点。

图2:抗冠状病毒药物设计策略。图片来源于参考文献1

非天然二聚体界面的晶体结构解析

为了进一步了解该靶点的具体特点以及筛选抑制剂,该团队首先解析了MERS-CoV N-NTD非天然蛋白间作用位点的晶体结构。作者将相互作用的MERSCoV N-NTD蛋白二聚体命名为单体1和2,再将二聚体界面分为两个区域:一个位于N末端柔性区,另一个位于N蛋白的β4和β5之间的环上。在第一个区域中,单体1的W43,N66,N68,Y102和F135产生了一个保守的疏水口袋,而单体2的M38的侧链则能通过疏水接触进入单体1的疏水口袋。此外,单体2的H37和N39则分别与单体1的W43和F135堆积,并有助于界面疏水作用。单体2与单体1之间的氢键作用则主要包括N39的侧链与N68主链形成氢键,以及残基G104,F135和T137的主链氧与Q73和T134的侧链形成三个氢键。在进一步的研究中,该团队发现二聚体状态是否稳定,需要通过单体2上的残基H37,M38来维持二聚体状态。此外,如果W43A突变会显著降低了N-NTD的寡聚趋势。还有一个重要的特点就是该二聚体界面具有疏水性。在这里,笔者不禁想说的是,对于药物的设计,靶点结构的解析往往至关重要,能够让我们更加有目标和方向。就如同生病吃药,必须对症下药,才能药到病除。从晶体结构我们可以了解到靶点的活性位点、结构性质、相互作用的位置等等,对接下来的全新药物设计具有很好的指导意义。

图3:MERS-CoV N-NTD的非天然二聚体界面结构。图片来源于参考文献1

先导化合物的筛选策略

那么,对非天然二聚体界面相互作用的解析以及界面的疏水性对于接下来先导化合物的筛选应该给予什么启发?而且该团队又是怎样设计筛选策略的呢?

首先依据对非天然二聚体界面相互作用位点的解析结果,该研究团队从模板中除去了H37和M38,以鉴定可以替代载体融合残基的化合物,并以N-NTD二聚体界面的疏水口袋中的W43进行了基于结构的虚拟筛选,初步筛选到了系列的配体。经笔者的分析,采用这个策略的主要原因是W43会影响MERS-Cov N-NTD蛋白的寡聚,以及H37和M38是维持二聚体界面稳定的主要残基。

然后基于非天然二聚体界面的疏水性的性质,该团队以所获得的配体N-NTD之间的疏水互补性(SL/L)和低拓扑极性表面积(TPSA)为标准,虚拟筛选出三个候选化合物:苄基-2-(羟甲基)-1二氢吲哚羧酸酯(P1),临床药物依托度酸(P2)和5-苄氧基谷氨酰胺(P3)。相较于化合物P1和P2,5-苄氧基谷氨酰胺(P3)具有较高的亲脂性匹配表面(SL/L)、对接分数(Socre)以及较低的拓扑极性表面积(TPSA),并能增加蛋白质色氨酸周围的微环境的刚性、疏水性以及稳定MERS-CoVN-NTD二聚体结构。重要的是,细胞毒性浓度(CC50=805.32μM)和有效浓度(EC50=32.1μM)实验结果也表明P3具有良好的治疗指数。因此,P3是极好的抗MERS-CoV候选抑制剂。

图4:候选化合物P1, P2及P3的结构式

P3诱导MERS-CoVN蛋白聚集

在筛选出最优的先导化合物P3后,接下来该团队首先要证明的问题就是该化合物是不是同预期设计的策略一样,能不能诱导冠状病毒N蛋白聚集?

该团队使用小角X射线散射(Small Angle X-Ray Scattering,SAXS)研究了P3对全长MERSCoV N蛋白结构的影响。全长MERS-CoV N蛋白与先导化合物P3结合后,会形成大的蛋白聚集体,并通过聚集体中的N-CTD(核衣壳(N)蛋白中的C末端域)自然形成拓扑封闭的八聚体,从而诱导N蛋白聚集而抑制MERS-CoV RNP(中东呼吸综合征冠状病毒核糖核蛋白复合体)的形成。

图5:与化合物P3结合后的蛋白聚集体。图片来源于参考文献1

抗病毒活性研究

进一步的细胞实验表明50μM的P3在48小时后对病毒滴度(病毒的毒力,单位体积内活病毒具有功能的病毒的量)的影响很小,但能明显抑制病毒RNA的复制。而100μM的P3在48小时后则完全抑制了病毒的产生和复制。另外,免疫荧光结果也表明了化合物P3可通过诱导细胞内核衣壳(N)蛋白的异常聚集而抑制MERS-CoV活性。

图6:化合物P3的抗病毒活性研究。图片来源于参考文献1

对抗SARS-Cov-2抑制剂设计的启示

来自中国科学院等机构的研究人员近日在Cell期刊上(Cell,2020, doi:10.1016/j.cell.2020.03.045)发表的研究成果表明MERS-Co和SARS-CoV-2蛋白的结构特征相一致[3]。此外,他们也发现SARS-CoV S表面的刺突糖蛋白(S蛋白)同MERS-CoV一样都会被宿主蛋白酶切割为分别负责受体识别和膜融合的S1和S2亚基。而S1可以进一步分为核衣壳(N)蛋白中的N末端结构域(N-NTD)和C末端结构域(N-CTD),其SARS-Cov-2的基因组则包装在核衣壳(N)蛋白中,形成核糖核蛋白(RNP)复合体。这是不是给了我们些许提示,是不是可以同样以SARS-Cov-2N-NTD(新型冠状病毒-核衣壳(N)蛋白中的N末端域)的非天然蛋白间的接触界面为靶点筛选出在细胞水平上诱导异常的全长N蛋白寡聚以及具有抗新型冠状病毒(SARS-Cov-2)作用的小分子化合物。当然,我们也必须要更加具体分析SARS-Cov-2N-NTD(新型冠状病毒-核衣壳(N)蛋白中的N末端域)的非天然蛋白间作用界面的特点。因为新冠病毒SARS-Cov-2的基因和特征虽然和MERS-Cov有很高的相似,但是些许的变化,都会造成其与人体的宿主细胞结合能力、传染能力、致病能力发生翻天覆地的变化,从而严重危害成千上万人的身体健康。

结语

在全球新冠肺炎疫情如此严峻的今天,全新的抗冠状病毒药物设计策略对目前正在肆掠和未来的冠状病毒治疗具有重要意义。目前,靶向冠状病毒的药物主要为血管紧张素转化酶2(ACE2)、RNA聚合酶、病毒蛋白酶以及病毒3CL水解酶,而以冠状病毒的非天然蛋白间相互作用界面(non-native protein−protein interaction)作为抗病毒抑制剂筛选靶点是一次新的突破。

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